1.4  双重实时荧光PCR反应体系的构建与优化

由于双重qPCR实验涉及到牛和羊两个物种的基因，首先构建了包含等浓度牛羊引物的双重PCR反应体系，并进行了三组实验。向实验组a的反应体系中加入40ng/牛DNA，向实验组b的反应体系中加入40ng/羊的DNA，向实验组c的反应体系中加入20ng/牛的DNA和20ng/羊的DNA，判断双重PCR反应的特异性和可行性。由于反应结果显示羊抑制牛，以等比例混合的牛DNA模板和羊DNA模板，作为双重qPCR反应的模板，依照1:1、1:2、1:4、1:6的羊引物和牛引物浓度比，对双重qPCR反应体系进行优化。确定最终双重qPCR反应体系为10 2×qPCR Master Mix (KAPA PROBE FAST)，0.2M goat-F，0.2M goat-R，0.1M goat-P，0.4M cow-F，0.4 M cow -R，0.2 M cow-P，0.4 L low ROX (KAPA PROBE FAST)，2 L DNA模板以及4.6 L无菌去离子水，总反应体系为20 L。扩增程序为95℃预变形5min；95℃变形20s，60℃退火40s为一个周期，共45个循环。