1.2.3 黄连NRAMP5基因的克隆

根据得到的黄连NRAMP5序列，设计特异性引物NRAMP5F：5’-ATGGAAAGTGAAAATACCCAAAAGG-3’，NRAMP5R：5’-CTATTTATTCTGATGTGTCATTTCAGC-3’。 以反转录得到的黄连叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，获得 NRAMP5 的全部基因编码序列。PCR 反应体系为：1μL KOD Dash，5μL 10 × Buffer for KOD Dash，5μL 2 mM dNTPs，3μL cDNA，34μL ddH2O，1μL Forward Primer （10 µmol/L），1μL Reverse Primer （10 µmol/L），共 50μL。PCR 反应程序为：95℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，62℃退火 30 s，74℃延伸 1 min30 s，32个循环；74℃补充延伸 10 min。

PCR 产物经切胶回收后，纯化产物与 pEASY- Blunt 克隆载体连接并转化至Trans1-T1感受态细胞，随机挑选阳性克隆经菌液 PCR 无误后送武汉天一华煜基因科技有限公司测序。