1.3 基因克隆

根据NCBI提供的绵羊PRDX5基因CDS序列，利用Premier 6.0软件设计引物，并对其特异性进行BLAST后送至西安擎科生物公司进行引物合成。以藏绵羊睾丸组织cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 mmol·L^-1）（表1）各0.5 μL，高保真DNA聚合酶（1 U·μL ^-1）10 μL，用ddH2O补至20  μL。PCR扩增条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34 个循环；72℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）纯化并回收目的片段，然后与载体pEASY-Blunt Cloning Kit进行连接，利用大肠杆菌（Escherichia coli）Trans1-T1感受态细胞进行转化，培养鉴定后随机挑选4个单菌株送至西安擎科生物公司进行测序。