2.3  蛋白印迹法（Western Blot）外泌体鉴定

配制10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后，用异丙醇封胶。当微微倾斜制胶器分界线不再变化时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层异丙醇并用滤纸将其吸干。配制4.8%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将梳子插入玻璃板中，剩余空间灌满浓缩胶，等待胶凝固即可。取60uL蛋白上清，加入15uL 5*loading buffer混匀，沸水煮15min，放入冰盒中速冷备用。根据蛋白定量的结果，第一孔点入marker 3uL，其它每空上样10-20uL已变性蛋白。开始电泳，电泳恒定电压75V，时间为120min。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。分别切胶HSP70（70KD），CD63（30-65KD），ALIX（97、80KD），GAPDH（36KD）。准备3张与胶同样大小的滤纸和1张NC膜，NC膜与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。按照3张滤纸，NC膜，胶的顺序依次放好，要求中间没有气泡。盖上仪器，接通电源，转膜300 mA恒定电流，ALIX约2h，HSP70约1.5h，CD63约70min，GAPDH约60min。转膜完毕后，将膜取出放入1*PBST中洗1次。用1*PBST配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后；室温放置60min，4℃过夜，次日室温放置30min。用1*PBST将一抗按照一定比例稀释（HSP70、CD63、ALIX 比例1：3000；GAPDH比例1：5000），将膜与一抗一起孵育；室温放置90min。孵育结束，1*PBST洗3次，每次15min。用1*PBST稀释HRP标记的二抗（1：6000），将稀释后的二抗与膜共同室温孵育90min。孵育结束，1*PBST洗3次，每次10min。ECL显色曝光：使用ECL化学发光液与膜孵育1min，用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光15min；显影冲洗，将曝光后的底片扫描，并用quantity one专业灰度分析软件进行分析。