1.2.6 qRT-PCR
我们根据天根生化科技有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，分别提取了15年生马尾松不同组织及8种处理下30d幼苗的RNA。利用超微量分光光度计测定总RNA浓度与OD260/280、OD260/230的值并进行凝胶电泳检测其弥散程度（方法同1.2.1），将检测结果符合要求的RNA作为模板进行反转录。8种处理包括非生物胁迫和激素处理，分别是机械损伤、15% PEG6000、10mM MeJA、50μM ETH、10mM H2O2、2mM GA、1mM SA和400μM ABA，其中机械损伤的处理方法是通过切断松针的上半部分、15%PEG6000处理方法是将植物浸泡在溶液中模拟干旱，其他胁迫和处理均采用喷淋植物表面的方式进行[26]。每个处理选择3株长势均匀的幼苗作为3个生物重复，每个植株收集3个样品作为3个技术重复，每隔0h、3h、6h、12h和24h取幼苗针叶作为样品，经液氮速冻后，冻存于-80℃冰箱中备用，其中在0h收集的样品未经任何处理用作对照组。利用Primer 5.0软件设计实时定量PCR特异性引物Q-PmNAC8-F和Q-PmNAC8-R，以本实验室筛选出的马尾松较稳定的Tubulin alpha基因（GenBank登陆号：KM496535.1）作为内参基因，并设计内参引物（表1），进行定量PCR反应[27]。将得到的cDNA模板稀释20倍，备用。反应体系和反应程序参考Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明书。
