2.3  RPA反应体系的建立

根据RPA检测试剂盒说明书进行加样，60 μL体系如下：

（1）①管：2.5 μL 10 μmol/L的上、下游引物，混合均匀；②管：29 μL 2× Reaction Buffer、9.6 μL 1.8 mmol/L dNTPs、6 μL 10× Basic E-Mix，充分混匀，向管盖加3 μL 20× Core Reaction，充分混匀^[12]。

（2）将②管的混合液取出，放入①管中，摇晃①管使其融合，再加入280 mM的Mg2+ 6.4 μL和60 ng/μL的核酸1 μL，轻轻拨弹①管使其融合^[13]。

（3）确定反应的最优反应时间：以60 ng/μL浓度的转Bt玉米基因组为模板，取最优引物，按上述体系添加试剂，反应温度为37 ℃，设置扩增时间分别为20 min、25 min、30 min、35 min、40 min。反应结束后取出产物，进行纯化处理，做2 % AGE，观察AGE结果，确定最优反应时间^[14]。