RNA测序建库进行反转录获得互补DNA，任意片段(包括其互补链)被切割和测序的几率是相同的，表达水平高的RNA其被测序几率就较高，可以获得拼接延伸机会就大。由于高通量的测序错误率不低，只是利用kmer节点进行重叠拼接延伸是不够的，利用较长的拼接重叠区是必要的。此外，序列拼接之后应可以追溯原始序列来源，另外可以根据匹配的原始序列高度相似性设计荧光定量PCR扩增的引物，不同组织的拼接序列进行比对可以发现可变剪接。