1.2.1 eutB基因突变菌株的PCR验证

将诱导eutB基因敲除后的菌液在卡那霉素平板上筛选，并随机挑取了12个单菌落，同时用出发菌株（H10407）作为阴性对照，提取DNA后使用eutB-outF和eutB-outR 引物进行PCR验证。出发菌株扩增产物长度为1525 bp，而eutB基因被卡那霉素抗性基因替换后扩增产物长度应为1045 bp。结果如图2所示，除了第2、6、11菌落外，其余扩增产物大小均与预期相符，可能为替换成功的阳性克隆。选择第1号菌落，在含有卡那霉素的LB平板上连续传代3次后随机挑取1个菌落，接种3 mL 含卡那霉素的LB肉汤培养基，37℃，220 rpm培养过夜，离心后提取菌体DNA用eutB-outF和eutB-outR 引物再次进行PCR扩增，并测序验证。测序结果显示与预期相符，提示eutB基因敲除成功，该菌命名为：Ecoli10407/ΔEutB::Kn。