1.３　RNA提取、反转录和实时定量PCR

使用TRIzol_试剂（美国Invitrogen，根据制造商的说明，从精子浆中分离总RNA，并用DNA酶I（Qiagen）处理以消除任何DNA痕迹。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Scientific，USA）在光密度（OD）260/280和260/230下对提取总RNA的质量和浓度进行分光光度测量。总RNA用30μL DEPC处理过的水洗脱并储存在− 80摄氏度。RT-PCR 采用Primescript RT reagent Kit（TaKaRa,中国）。首先使用Primescript  RT Enzyme Mix I 对上步处理后的RNA样本进行反转录应 。反转录应后，选择 TB Green Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus ，Code No: RR820A/B）在Applied 7300/7500 Real PCR System进行三步法实时PCR扩增反应。反应结束后确认实时PCR的标准曲线，扩增曲线和融解曲线并进行实验结果分析。snRNAU6和人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内源性对照。使用比较Ct（2^-△△Ct）方法计算相对miRNA和mRNA表达。每个实验结果重复三次。