1.2.2 低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein ,LDL)的制备、氧化修饰及修饰程度鉴定
LDL的制备采用两步超速离心法。LDL的氧化修饰则在新鲜的LDL中加入 含氯化铜(copper chloride,CuCL2)的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline ,PBS)中,使CuCL2终浓度为10umol/l, 使LDL在20℃氧化24h,其硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)值升高,电泳速度加快。然后在含0.01%EDTA的PBS中透析.每2h换液1次,透析24h,除菌保存。
1.2. 3 平滑肌源性FC模型的制备及处理
取3-5代细胞消化后,改为0.5%FBS+DMEM/F12培养24 h,加入100ug/ml的ox-LDL作用72 h,使VSMC转化为FC,建立FC模型[5]。FC形成通过油红染色证明。取3-5代VSMC消化后,加入100mg/ml的ox-LDL作用72小时,建立平滑肌源性FC模型。取3-5代VSMC消化后,在加入100mg/ml的ox-LDL作用同时,分别加入葡萄糖,葡萄糖+1umol/L胰岛素,葡萄糖终浓度为20%,共孵育72小时,取细胞用于实验。