1.3.2 PCR检测目的基因mRNA表达水平
参照RNA提取试剂盒Total mRNA Extract kit (Omega)操作手册提取总RNA。取2 µL(2.3.1)所得的 RNA 溶液进行定量,确认RNA完整无降解。
取1 µg所得的总RNA,根据 M-MLV First Strand Kit操作手册反转录合成cDNA,按说明将反转录产物按照 1: 25稀释,并按比例配制反应的体系进行时定量 PCR 反应及反转录 PCR 反应,1.5%琼脂糖凝胶进行恒压电泳。RNA的相对定量法采用比较Ct法,选择GAPDH作为内参基因,计算各组∆Ct值(Ct目的-Ct内参),用2-∆Ct计算将统计数据转化为目的RNA的表达量。为保证实验结果的可靠性,每次进行电泳时,均选择以一超纯水做空白对照。电泳结果在紫外光下进行观察,并用凝胶电泳图像系统进行分析。