猪CD163基因的单碱基编辑研究

《畜牧兽医学报》2022年第4期 | 赵为民王慧利曹少先郭日红王泽平陈哲徐奎付言峰李碧侠任守文程金花江苏省农业科学院畜牧研究所江苏省农业种质资源保护与利用平台南京210014 农业农村部种养结合重点实验室南京210014 江苏省农业科学院宿迁农科所宿迁223800 中国农业科学院深圳农业基因组研究所深圳518124

摘　要：旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C>T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止。利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为AA,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。PCR扩增CD163-sgRNA和YE1-BE3-FNLS载体中的APOBEC-Cas9n-UGI片段,通过体外转录形成CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA。体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活,利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射,待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段,提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序。结果显示,在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA,利用PCR成功扩增了CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段,注射CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA后的猪孤雌胚胎发育到2~4细胞期。挑选注射的20个2~4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C(num1479)>T,单碱基编辑效率约60%。对CD163-sgRNA的off-target分析发现,在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域,对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C>T的突变。本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑,成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479)C变为T,从而使得密码子CAA变为TAA,可提前终止CD163基因的翻译。

摘　要：旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C>T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止。利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为AA,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。PCR扩增CD163-sgRNA和YE1-BE3-FNLS载体中的APOBEC-Cas9n-UGI片段,通过体外转录形成CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA。体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活,利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射,待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段,提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序。结果显示,在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA,利用PCR成功扩增了CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段,注射CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA后的猪孤雌胚胎发育到2~4细胞期。挑选注射的20个2~4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C(num1479)>T,单碱基编辑效率约60%。对CD163-sgRNA的off-target分析发现,在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域,对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C>T的突变。本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑,成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479)C变为T,从而使得密码子CAA变为TAA,可提前终止CD163基因的翻译。

【分　类】	【农业科学】 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
【关键词】	CRISPR/Cas9 单碱基编辑 CD163基因猪
【出　处】	《畜牧兽医学报》2022年第4期 1041-1050页共10页