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1925年夏,上海发生"五卅"惨案,他积极组织学生罢课、集会演讲,愤怒控诉帝国主义屠杀中国同胞的罪行。此后,又作为学生代表到安徽省宿州等地巡回演讲,报告"五卅"惨案的真相,组织沪案后援会。不久加入了中国共产党。
1926年3月,他担任中共南洋大学党支部书记。10月,任中共上海法租界部委组织部长。1927年1月,任闸北部委组织部长。1926年10至1927年3月,参加了上海三次工人武装起义,组建工人纠察队,带领学生支援工人的斗争。
1927年夏,陈育生被捕入狱,关押在龙华监狱。在狱中,坚持斗争,组织狱中难友会,并作囚歌鼓励难友。面对敌人严刑逼供,宁死不屈,始终没有暴露共产党员身份。1928年秋,被党组营救出狱,调到中共河南省委负责青年学生运动工作。在开封女子师范学校以教书为掩护领导学生运动。