此方法主要通过辣根过氧化酶（HRP）催化底物，并以卵白素-生物素-酶复合物（ABC）作为生物信号放大系统进行双重染色。因为卵白素和生物素标记二抗的亲和力强，所以ABC法检测抗体的敏感性高^[7]。王蕾等^[8]利用此方法，研究视交叉上核（SCN）和室上核（SON）的纤维联系，分别选择3,3'-二氨基联苯胺（DAB）和3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）作为底物，清晰地观察到免疫反应产物分别为棕色和绿色。此外，聂红等^[9]采用该方法，先后以硫酸镍铵增强的DAB和DAB作为底物，在大鼠脊髓背角观察到Fos蛋白和蛋白激酶Cβ亚型双标阳性神经元。但崔白苹等^[5]认为这种底物使用次序会出现第二标背景较深，以及阳性信号显色较弱的情况，导致两者对比度显著降低。因此，他们先后以DAB和硫酸镍铵增强的DAB作为底物，观察到免疫组化双标色彩更加鲜明，对比度更高，且无交叉反应，从而建立了一种清晰、高质量的双重染色方法。