浅析姜黄素对心肌细胞缺血再灌注损伤的作用及机制研究

目的观察姜黄素对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其可能机制。方法通过培养H9C2心肌细胞进行体外模拟心肌细胞缺血再灌注实验。给予Cur预处理心肌细胞，按随机区组法分为对照组、缺血组、姜黄素+缺血组、姜黄素+3-TYP（SIRT3抑制剂）+缺血组、3-TYP+缺血组。采用MTT法检测不同浓度姜黄素预处理对心肌细胞存活率的比较，TUNEL法检测心肌细胞凋亡，Western blotting法检测心肌细胞沉默信息调节因子（SIRT3）、AcSOD、BCL2、BAX表达水平，氧化应激试剂盒检测SOD、GSH和MDA氧化应激指标。结果与缺血组比较，姜黄素组（2.5,5,10μM）预处理显著增加细胞存活率（P <0.01）；不同浓度的姜黄素组组间比较，姜黄素（5,10μM）组与姜黄素（2.5μM）组比较显著增加细胞活力（P <0.01）。姜黄素（5μM）组与姜黄素（10μM）组比较，无统计学差异（P＞0.05）。与对照组和缺血组比较，观察到Cur预处理显著降低心肌细胞凋亡指数（P <0.01）。与缺血组比较，姜黄素+缺血组和姜黄素+ 3-TYP + 缺血组的SOD和GSH活性显著升高（P <0.01），姜黄素+缺血组中MDA水平显著降低（P <0.01）；与姜黄素+缺血组比较，姜黄素 + 3-TYP + 缺血组和3-TYP +缺血组中MDA的水平显著增加（P <0.01）。与缺血组比较，姜黄素+缺血组心肌细胞BCL2、 SIRT3表达水平显著增加（P <0.01），Bax和AcSOD表达水平显著降低（P <0.01）；与3-TYP预处理组比较，姜黄素预处理对SIRT3和乙酰化SOD的表达水平被逆转（P <0.01）。结论姜黄素可以对心肌细胞缺血再灌注损伤起保护作用，其机制可能与姜黄素通过上调AcSOD水平而促进SIRT3的表达而发挥抗损伤的保护作用。

姜黄素（Cur）1,7-双（4-羟基-5-甲氧基苯基）-1,6庚二烯-3,5-二酮（二糠基甲烷），是一类从姜黄根茎中分离出的天然产物（姜黄），该草药已被广泛应用在中国和南亚^[3-5]。姜黄是姜科植物，其根茎可入药，气香特异，味苦、辛，性温，归脾、肝经；具有破血行气、通经止痛功能，用于胸胁刺痛、胸痹心痛、痛经经闭、癥瘕、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛^[6]。姜黄素是具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面药理作用。研究显示Cur减轻脑、肾、视网膜、肝脏、和结肠的缺血再灌注损伤^[7-10]。有相关研究报道姜黄素后处理通过激活预存活信号通路减轻IR损伤^[9,11]。沉默信息调节因子3（SIRT3）^[12-16]在肿瘤、炎症、卡路里限制延长寿命及心肌肥厚等方面有相关研究，其对抗氧化应激从而发挥保护作用，但是姜黄素能否通过SIRT3保护心肌细胞缺血再灌注损伤目前仍缺乏相关研究。因此，本研究旨在探讨姜黄素预处理心肌细胞缺血再灌注损伤模型，拟观察姜黄素对IRI的保护作用及SIRT3所介导的相关机制。

1.材料与方法

1.1材料

姜黄素、MTT (美国Sigma公司)； Bcl2, Bax，Sirt3，β-actin抗体（美国Santa Cruz公司）；3-TYP（由重庆大学IDRC创新药物研究中心合成）；二抗（北京中山科技有限公司）；TUNEL试剂盒（德国Mannheim公司）. MDA，SOD，GSH试剂盒（南京建成生物科技有限公司）.

1.2方法

1.2.1选择姜黄素浓度及细胞培养与处理

将心肌细胞随机分为对照组、缺血组和Cur（2.5,5,10μM）组（n = 8）。还比较了0.1和100μMCur对H9C2的影响。 MTT结果表明，0.1μMCur对细胞活力的改善几乎没有影响（vs IR组，P> 0.05），而100μM的Cur对提高细胞活力的影响不如10μM的效果好（P <0.05））。然而，比较5μM和10μM的作用（P <0.05）。结果，选择5μMCur用于本研究。

H9C2在补充有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100U / mL青霉素和100g/ mL链霉素的DMEM培养基（Hyclone，UT，USA）中，在37℃，5％CO ₂和95％空气中培养。在DMSO中制备姜黄素储备溶液，并在实验之前立即用培养基稀释。 DMSO（0.01％）用作对照组。在进行处理后，获取细胞用于进一步分析。

1.2.2细胞存活率测定

通过MTT实验方法评估H9C2心肌细胞活力。预处理的细胞用PBS洗涤后，加入100μL 0.5mg / mLMTT溶于无酚红DMEM中的溶液，37℃孵育4h。使用分光光度计（SpectraMax 190，Molecular Device，USA）在490nm测定结果，细胞存活率通过光密度（OD）值表达。

1.2.3细胞凋亡实验

通过使用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL测定来分析细胞凋亡。根据制造商的说明书使用双染色技术。将H9C2在4％多聚甲醛中固定24小时后，进行TUNEL测定以染色凋亡细胞的细胞核（绿色），并使用4'6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色所有核（蓝色）。凋亡指数表示为阳性染色的凋亡H9C2的数目/ H9C2的总数×100％。

1.2.4细胞内SOD，GSH-Px和MDA浓度测定

如前所述[38]，使用试剂盒测定细胞内SOD，GSH-Px和MDA的活性。所有实验完全按制造商的说明书进行。酶活性表示为每毫克蛋白质的单位。用于测量SOD活性的测定基于SOD抑制由黄嘌呤 - 黄嘌呤氧化酶系统产生的O₂^-氧化羟胺的能力。一个单位的SOD活性定义为在550nm处吸光度降低50％的量。通过定量由催化的还原型谷胱甘肽氧化的谷胱甘肽被H₂O₂氧化的速率来进行测量GSH-Px活性的测定。一个单位的GSH-Px定义为在1min/ mg蛋白质中在412nm下将GSH的水平降低1μM的量。通过其与硫代巴比妥酸的反应在532nm测量MDA，以形成稳定的发色产物。 MDA水平表示为纳摩尔/毫克蛋白质。

1.2.5心肌细胞的制备和模拟缺血再灌注（SIR）治疗

使用先前报道的方法H9C2的原代培养物培养[20]。简言之，将心肌细胞暴露于含有以下试剂的缺血缓冲液（mM）：NacI（137），KCl（12），Mgcl₂（0.49），CaCl₂·2H₂O（0.9）和Hepes（4）。该缓冲液还补充有以下化合物（mM）：脱氧葡萄糖（10），连二硫酸钠（0.75）和乳酸盐（20）。缓冲液pH为6.5，并将细胞在潮湿的细胞培养箱（21％O₂，5％CO₂，37℃）中孵育1.5小时。在正常空气和培养基条件下再灌注4小时。

1.2.6蛋白质印迹分析

将H9C2样品在含有50mmol / L Tris-HCl（pH 7.3），150mmol / L Nacl，5mmol / L EDTA，1mmol / L二硫苏糖醇，1％Triton X-100和1％蛋白酶的裂解缓冲液抑制剂混合物中。将12,000g裂解物离心15分钟，得到的上清液转移至新管中并在-70℃下储存。使用Bradford蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。将膜在含有5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水和吐温20（TBST，pH 7.6）中封闭1小时，然后在4℃下用针对SIRT3（1：500稀释），Bcl2，Bax， SOD2和β-actin（1:1000稀释）抗体中孵育过夜。印迹用TBST洗涤。然后在室温下用合适的第二抗体（1:5000稀释）探测膜90分钟，并用TBST洗涤。通过化学发光检测蛋白质条带并用Quantity One软件包（West Berkeley，CA，USA）测定。对照组的结果定义为100％。