1材料和方法
1.1材料Ishikawa 细胞由本室保存并常规培养; RPMI1640培养基购自Gibco 公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; TRIzol Reagent 和脂质体Lipofect3000购自Invitrogen 公司; 干涉序列由上海上海生工生物工程有限公司合成; NC膜ECL 化学发光试剂购自Thermo公司;EZH2、SUZ12抗体购自Abcam 公司; Western blot 蛋白预染Marker 购自Bio-Rad公司; PrimeScript反转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq购自Promega公司
1.2方法 细胞培养 Ishikawa 细胞用含10% 胎牛血清、100U/L 青霉素和100U/L 链霉素双抗的RPMI-1640 培养液,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。每1 -2天更换新鲜培养基,当细胞融合度达到80% -90%时进行传代培养。
1.2.1转染 将细胞培养于6 孔板,以只转染脂质体为阴性对照组,100nmol /L 浓度为实验组,每组平行3 孔,按LipofectamineTM3000说明书依次转染,HOTAIRsiRNA的靶序列为( Sense:5'-GAACGGGAGUACAGAGAGAUU-3') 转染后48h 收集各组细胞用于qPCR分析。
1.2.2 qPCR 检测各组HOTAIR 基因表达转染36 h 后从MDA-MB-231 细胞提取总RNA,反转录为cDNA。以F1( GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC)R1( ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC)为HOTAIR 引物,F2( GCTGAGAACGGGAAGCTTGT),R2( GCCAGGGGTGCTAAGCAG) 为GAPDH 引物进行qPCR。qPCR 反应条件: 94℃ 30s, 95℃ 1min,55℃30s,95℃30s然后94℃5s,60℃30s,40个循环。
1.2.3 Western blot 检测目的蛋白的表达转染48 h 后提取Ishikawa 细胞总蛋白质,用BCA 试剂盒进行蛋白定量; 根据目的蛋白分子量配制12 g /L 的SDS-PAGE 分离胶,常规电泳分离蛋白,然后将蛋白转移至NC 膜,50 g /L 脱脂奶粉室温封闭1 h后,加入兔抗人EZH2 抗体( 1∶500)或SUZ12( 1∶1 000)室温摇床温育1 h 后4℃冰箱过夜; 一抗处理后用 TBST 洗膜3 次,每次10 min,然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体( 1 ∶ 4 000) ,室温摇床温育30 min 后以TBST 洗膜3 次,每次10 min,用ECL化学发光显影。PVDF膜以化学发光试剂盒进行显色,采用自动凝胶成像系统成像,以Tanon5200软件对蛋白印迹条带进行处理和分析。
2结果
2.1 qPCR检测各处理组HOTAIR的表达 阴性对照组只加脂质体,转染组采用100nmol /L 的转染浓度进行干涉。阴性对照组HOTAIR 基因表达水平明显高于转染组,( P < 0.05,) ,说明干涉效果明显。
2.2 EZH2蛋白的表达
阴性对照组只加脂质体,转染组采用100nmol /L 的转染浓度进行干涉。 HOTAIR-siRNA转染可明显抑制模型细胞中EZH2蛋白表达。
2.3 SUZ12蛋白的表达
阴性对照组只加脂质体,转染组采用100nmol /L的转染浓度进行干涉。 HOTAIR-siRNA转染可明显抑制模型细胞中SUZ12蛋白表达。