以干细胞治疗为基础的再生医学在心血管疾病治疗上的应用，是人类战胜心血管疾病向前迈进的重要一步。诱导多能干细胞和胚胎干细胞都具有维持自我更新和广泛的分化潜能的特性，其中内皮细胞分化在血管生成过程起关键作用，在胚胎发育和出生后心血管疾病的发展中扮演重要角色。miRNAs是一类由22个核苷酸构成的内源性非编码小RNA，其特异性地与靶标mRNA的3′端非编码区相结合，是基因表达调控的关键因子，在胚胎发育和疾病的病理生理过程中扮演重要角色。
一、miRNA的生物合成及作用机制
Lee和Wightman等（1993）首先发现miRNAs可在转录后水平上调控基因的表达。绝大多数miRNAs是由RNA聚合酶II来进行转录，但某些miRNAs也可以通过RNA聚合酶III进行转录。在哺乳动物细胞，原始转录物被细胞核内双链RNA内切酶剪切成60～70nt的前体miRNAs（pre-miRNAs），然后通过Exportin-5与其辅助因子Ran-GTP转运到细胞浆。最后，由Dicer酶剪切生成长度约为21nt的成熟体miRNAs。成熟的miRNAs最终被转运到Argonaute蛋白上并可沉默mRNA。
目前，已经明确的调控分子机制主要有三方面：一是通过小片段干扰RNA（siRNA）机制对mRNA进行特异性降解，其特异性表现为，被降解的mRNA要具有与miRNAs精确互补的核苷酸序列；另一方面，miRNAs通过目前不明原理的途径控制蛋白的翻译，这一功能只需要靶mRNA与miRNAs序列不精确的互补；第三方面，有发现提示，一些内含子源性miRNAs可能在转录水平对基因的表达进行调控。
二、miRNAs与干细胞的多能性
1、干细胞的分化潜能
胚胎干细胞多能性的维持受到干细胞特异性转录因子的调控，包括Nanog、Sox2和Oct3/4,同时还受到KLF4、c-Myc和Lin28等多能性因子的调控，这些因子共同形成网络调控干细胞的自我更新和定向分化［1］。miRNAs在干细胞的表达是通过这些关键因子来实现的，但其机制尚不清楚。Marson等［2］证明了调控因子Nanog、Sox2、Oct3/4及Tcf3靶向小鼠胚胎干细胞的miRNA启动区，进而使多能干细胞沉默，这可能是让干细胞处于待发状态，使之后能够更快更高效的分化。
目前，已揭示间充质干细胞具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞［3］、肝细胞［4］、神经细胞［5］、心肌细胞［6］、血管内皮细胞［7］和胰岛细胞［8］等分化的潜能。
2、miRNAs与干细胞多能性的调控
研究显示，当细胞分化过程启动，多能细胞的一些相关特异性miRNAs水平降低。敲除小鼠胚胎干细胞的DGCR8导致细胞周期的异常［9］。进一步探究发现，将敲除小鼠胚胎干细胞DGCR8作为对照，研究266个小鼠的miRNAs并鉴定其细胞周期表型，其中一些miRNAs的亚型被鉴定出来［10］，如miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-294、miR-295和miR-302，它们具有重塑细胞周期的能力，被定义为胚胎干细胞特异性细胞周期调控miRNA，上述的miRNA通过与cyclinE-Cdk2复合物、Cdkn1a、Rb1、Rbl1、Rbl2、Lats2等抑制因子结合来促进G1期向S期的转变。敲除Dicer的人类胚胎干细胞导致增殖缺陷，表明miRNA在调控细胞周期中的重要作用，并预测miR-302参与调控细胞周期。miR-302基因簇包含一系列的miRNA，如miR-302b、miR-302c、miR-302a、miR-302d及miR-367，其在内皮细胞中特异性表达，其中miR-302b、miR-302c、miR-302a、miR-302d在成熟形态高度相似，表明存在一些共同的靶基因mRNA［11］。测定不同的人类胚胎干细胞系，发现在早期分化中，miR-302基因簇下调，Card等［12］发现转录因子Nanog、Oct4和Sox2在人类胚胎干细胞中靶向miR-302基因簇的启动子区域，其中Oct4和Sox2对miR-302a进行转录调控。Oct4与miR-302共同作用调控NR2F2（COUP-TFII）的活性，NR2F2属于转录因子NR2F2/COUP-TFII核受体家族，在分化中伴随Oct4与miR-302水平的降低，其转录活性升高，表明miR-302对多能性的调控起重要作用。
在内皮细胞中，增殖周期的缩短是因为G1期延长，而使S期所占的比例增加。研究发现细胞分化导致G1期延长。MiR-302a在初期非多能性细胞中表达，发现处于G1期的细胞数目降低，而S期数目升高，相反，抑制miR-302在多能性细胞的表达，导致处于G1期细胞数目升高。miR-302家族靶向一些细胞周期调控蛋白，Card等证实miR-302在转录后水平调控cyclinD1的表达，随着Oct4和Sox2激活miR-302转录，miR-302抑制细胞周期调控蛋白，预测在人类胚胎干细胞中多能性的调控子（Oct4/Sox2）与细胞周期的调节存在关联。
此外，研究还发现一些胚胎干细胞特异性miRNAs在干细胞多能性的维持上发挥重要作用，如miR-371基因簇、miR-290基因簇及miR-17-29基因簇［13］，这些miRNAs拥有相似密码子序列，表明上述miRNAs的靶标mRNA存在重叠，部分细胞周期调控因子共同靶向相同的mRNA。
3、干细胞定向内皮分化
Liang等［14］开展了体外诱导BMSSC分化血管内皮细胞实验，他们将血管内皮生长因子（VEGF）和bFGF与BMSSC共培养3～21天，发现BMSSC先后表达CD34、CD31、FLt-1（VEGFR-1）、FLk-1（VEGFR-2）和vWF等血管内皮细胞特异性蛋白。此外，Mieno等［15］通过在低血清培养基中添加VEGF，对BMSSC进行诱导培养，换液过程中不断去除非粘附细胞，2周后收集的细胞除了表达血管内皮细胞特异性因子（VEGFR、VE-粘附蛋白、VCAM-1和vWF）外，还在半固体培养基中形成了具有毛细血管样的结构。表明VEGF不仅作为血管内皮细胞特异的有丝分裂原，在胚胎发生和创伤愈合过程中发挥启动血管形成和促血管生长的作用，而且具有调控间充质干细胞分化血管内皮细胞以抵抗因低氧胁迫造成的血管损伤等功能。
进一步研究显示，低氧环境与VEGF促进BMSSC向血管内皮细胞分化的机制相似，它们都可以上调促血管生成的细胞因子，如FGF、VEGF、VEGF受体（KDR）和FLT-1等，这些因子在血管生成及促进毛细管样结构形成过程中发挥重要作用。
三、miRNAs与血管内皮分化
1、miRNAs与内皮细胞
内皮细胞参与血管发育过程，内皮细胞受损、活化和修复与心血管疾病的发生和发展密切相关。研究表明，miRNA在心血管病理生理过程中起着重要的调节作用，它参与心脏发育、心肌重构、高血压、血管病变、糖尿病及炎症等生理病理过程；某些miRNA广泛参与内皮细胞功能的调控，对维持血管内皮功能的稳定性起重要作用；另外，部分miRNA与血管内皮细胞的增殖、迁移、凋亡、分化的发生发展密切相关。
研究发现，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）主要表达在内皮细胞。eNOS基因中某些点突变或片段缺失，已被视为心血管疾病的重要危险因素。研究显示，eNOS通过某些细胞因子的激活诱导血管内皮细胞增殖。我们前期工作发现，27碱基重复子以加强子方式对eNOS基因的转录效率进行调节，外源性双链27碱基RNA明显抑制eNOS基因的转录效率。同时还发现，miRNA-24高表达组内皮细胞增殖速度降低，eNOS蛋白显著减少，而抑制组与高表达组相反，提示miRNA-24参与内皮特异性eNOS基因调控。
2、miRNAs对内皮定向分化的影响
在干细胞向内皮细胞分化的分子机制中，microRNA是一个关键的调控因素［16-17］。在ESC的研究中，通过特异敲除参与miRNA合成途径的Dicer酶，使ESC向内皮细胞系分化的潜能受到抑制，不能形成典型的内皮细胞形态结构，各种特异的内皮细胞标志基因表达降低，证明了miRNA对多能干细胞的内皮分化潜能亦具有重要的调控作用［18］。目前多个能调控干细胞的内皮分化潜能的miRNA相继被发现和证实，如miR-126［19］，miR-424［20］，miR-200c和miR-150［21］。另外，一些负调控内皮分化和血管新生的miRNA也被发现，如miRNA-101［22］、miRNA-200b［23］、miRNA-15a和miRNA-16［24-25］。
3、miRNAs对内皮定向分化的分子机制
在胚胎干细胞的血管内皮分化研究中，内皮基因的表达在内皮细胞形成的起始阶段出现，其中CD31的出现最早，是内皮细胞的重要标志之一，CD31是内皮间连接的主要分子，调节细胞迁移、血管新生和细胞粘附整合的功能。研究发现，miR-495在CD31阳性细胞低表达，而在非内皮特征的细胞的表达相对较高，与内皮分化的方向呈负相关，这提示miR-495可能作为iPSC向内皮分化的负性调控因子，一些特异的转录机制抑制miR-495在iPSC的表达，并能促进内皮细胞的分化，而miR-495表达水平不变化的iPSC可以转化为其他类型的细胞。有研究发现miR-495在胚胎干细胞形成内皮细胞的分化过程中表达降低，而过表达miR-495能抑制胚胎干细胞的中胚层分化，证明miR-495是抑制胚胎干细胞分化的调控因子。通过抑制miR-495的表达和功能，进一步验证其对iPSC向内皮细胞分化的影响，发现抑制miR-495能诱导iPSC在基质胶上形成管状网络结构，表明诱导的iPSC将具有更加成熟的成管能力，抑制miR-495能诱导分化iPSC的细胞膜表达VE-Cadherin和CD31，并能在细胞间隙形成紧密的连接结构，具有内皮相关的功能，VE-Cadherin是钙粘蛋白超家族的一员，是一种钙依赖性细胞-细胞粘附蛋白，在内皮细胞间连接起重要作用，决定内皮层的渗透性，维持内皮屏障功能的平衡。结果表明抑制miR-495能促进iPSC向内皮细胞分化。
miRNA-495抑制剂能解除miR-495对VEZF1转录后抑制作用，从而促进VEZF1表达增加，可能参与了iPSC内皮细胞分化的作用机制。而VEZF1作为一种重要的转录因子，已经被证明能调控血管细胞分化和发育［26］。在小鼠胚胎发育的血管发生过程中，VEZF1主要在血管内皮细胞表达，决定了内皮细胞的分化方向［27］。然而，miR-495存在其他的潜在靶基因，同时调控iPSC的内皮细胞分化。Wnt［28］、VEGF［29］、TGF-β［30］、MAPK［31］和细胞周期［32］等信号通路对内皮细胞的分化或者血管新生具有重要的调控作用。其中，DNMT3a作为miR-495的靶基因，miR-495能结合其3′UTR，并抑制DNMT3a的表达，从而抑制ESC向中胚层的分化［33］。因此，miR-495可以通过不同的靶基因，发挥广泛的生物效应。
还有研究通过VEGF诱导小鼠iPSC向内皮细胞分化，并采用TaqMan miRNA Array的方法从375个miRNA中筛选调控内皮分化的基因，发现了miR-21表达水平上调，并通过TGF-β和Akt等信号通路调控iPSC的内皮分化，此外有研究发现miR-17、miR-18、miR-19和miR-20在内皮分化过程中表达上调，它们所对应的pri- miRNA在转录水平上呈下调［34］。