1.6.4第二层覆盖液铺板时间的优化

确定第一层覆盖液铺板时间后，分别在完成第一层覆盖后24、36、48、56、72ｈ 覆盖第二层覆盖液，待第二层覆盖液完全凝固后，置于37℃ 、体积分数为5％ CO₂培养箱正置培养，每3 h观察蚀斑形成情况。

1.6.5蚀斑挑取、扩增及鉴定

待蚀斑形成后用修剪好的黄色枪头挑取噬斑，并放入500 μL 的无血清DMEM中, 反复冻融3次后，取200 μL提取RNA，采用RT-PCR进行鉴定^[8-9]。鉴定结果为FCV阳性的再次进行蚀斑试验，取上清继续克隆纯化，经3轮纯化RT-PCR鉴定结果为FCV阳性且FHV-1鉴定结果为阴性的病毒液扩大培养， -80 ℃保存备用。

2. 结果

2.1病毒RT-PCR鉴定结果

混合病毒接种F81单层细胞后，发现F81细胞出现变圆、脱落、细胞聚集在一起呈葡萄串样典型细胞病变效应（CPE）。将收取的病毒培养液，按照艾德莱病毒RNA提取试剂盒及病毒DNA提取试剂盒说明书提取病毒总RNA及DNA，以获得的RNA及DNA为模板，进行FCV、FHV-1 PCR检测。PCR产物经凝胶电泳检测后显示，在452 bp及474 bp处分别出现特异性片段(图1)。表明病毒为FCV和FHV-1混合病毒。