结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，全球第三大最常见的癌症，是因癌症死亡的第二个最常见疾病，每年约有608万人死于CRC[1]。CRC发生发展的病理机制十分复杂，仍不十分清楚。目前认为，基因突变是癌变过程中最早涉及的初级遗传事件,而在CRC发展过程中将会引发次级分子事件,即基因表达改变,如差异性表达、可变剪接与融合基因。近几年，一些基因表达的可变剪接体与肿瘤的关系受到重视，γ-内收蛋白（gamma adducin,ADD3）可变剪接体就是其中的一个。已有报道ADD3可变剪接的表达差异跟非小细胞肺癌[2]及小鼠乳腺癌细胞[3]有关，本实验小组在前期工作中发现一例CRC患者的ADD3可变剪接在CRC与正常组织的表达存在差异[4]，这些均引起我们进一步探讨ADD3可变剪接体与CRC关系的兴趣。
ADD3是人类内收蛋白γ亚单位基因，定位于染色体10q24.2-24.3,含15个外显子。ADD3是1986年Gardner等在红细胞中发现的一种细胞膜骨架蛋白，其有参与细胞膜骨架网状结构构建和维持、细胞信号转导、细胞膜离子转运等多项生理功能[5]。由于启动子选择和剪接方式不同，ADD3基因产生3种mRNA差异剪接体，即变体1（variant1），变体2（variant2），和变体3（variant3），表达2种蛋白：ADD3亚型a（isoform a），由变体1翻译，表达第14号外显子；ADD3亚型b（isoform b），由变体2和变体3翻译，第14号外显子表达缺失。本研究探讨CRC中，总ADD3 mRNA（ADD3-T）、ADD3亚型a（ADD3-Ia）和ADD3亚型b（ADD3-Ib）的变化及其意义。

材　料　和　方　法
1 组织和细胞
1.1 CRC和息肉组组织 在知情同意的情况下收集2012年9月～2013年6月于本院胃肠外科及肿瘤外科手术的50例CRC患者的癌组织及距离癌灶>5cm的上游正常粘膜组成配对样本，20例息肉患者在肠镜下取出的息肉组织及距离息肉>5cm的上游正常粘膜组成配对样本。所有样本均在20min内切下即放入RNA保存液，所有病例术前均未接受化疗，放疗及生物治疗，所有标本均经病理学检查证实。
1.1 结直肠癌细胞株 采用国内外通用,来自同一亲本,遗传背景一致的人大肠癌高转移性细胞株 SW620 和低转移性细胞株 SW480[6]。SW480购自中科院上海细胞研究所，SW620由福建省肿瘤医院研究室赠予。
2 主要试剂
RNA保存液、TRIzon总RNA提取试剂、GoldStar TaqMan Mixture(With ROX)购自北京康为世纪生物科技有限公司；RevertAid™第一链cDNA Synthesis试剂盒购自Thermo；不完全L-15培养基购自南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清购自天津灏洋生物制品有限公司；胰酶购自Gibco；噻唑蓝（MTT）购自Amresco。所用引物和探针由上海英潍捷基公司合成，见表1。
3 主要方法
3.1 细胞培养 细胞置于含10%胎牛血清不完全L-15培养中，37℃，5%CO2 饱和湿度培养箱中培养，2-3天换液一次，实验用细胞为状态良好的对数生长期细胞。
3.2 MTT比色法 将SW620和SW480接种于96孔培养板，100μl/孔，每孔接种细胞数为2×103，每组设3个复孔，培养24h；吸弃孔中培养基，加入100μl含有浓度为0μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml的奥沙利铂培养液或浓度为0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的5-FU的培养液培养24h，加入5mg/ml的MTT 10µl，37℃孵育4h后小心吸去上清，加入150ul二甲基亚砜（DMSO），振荡溶解结晶后用490nm波长比色，评价细胞存活率。实验重复3次。
3.3 药物干预 将SW620和SW480接种于6孔培养板，2ml/孔，每孔接种细胞数为5×105，每组设3个复孔，37℃，5%CO2 饱和湿度培养箱中培养24h细胞贴壁后吸弃培养液，加入不含血清的培养液2ml，饥饿培养24h后分别换用含有浓度为0μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml的奥沙利铂培养液及浓度为0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的5-FU的培养液2ml，24h后用TRIzon试剂收集各孔细胞。实验重复3次。
3.4 FQ-RT-PCR 将收集的细胞和组织按照TRIzon总RNA提取试剂的操作说明书进行总RNA的提取，紫外分光光度计比色后选用A260/B280在1.8～2.0的标本1μg逆转录成cDNA。取50ng cDNA进行FQ-RT-PCR,95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火60s，扩增40个循环。
4 统计学处理
采用国际通用的FQ-RT-PCR相对定量2-∆∆Ct方法[7]表示ADD3-T、ADD3-Ia、ADD3-Ib和ADD3-Ia/Ib的表达水平，实验数据采用均数±标准差（）表示，两组间均值的比较采用t检验，病理分析运用非参数Mann-Whitney U检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）LSD-t法，所有统计学处理均在SPSS17.0统计软件包上进行。
结 果
1 CRC组织
1.1 CRC组织表达量比较 ADD3-T在CRC中的表达水平较正常组织明显减低（0.704±0.334 vs 1.042±0.291，P<0.01），50例中有37例（74%）减低；ADD3-Ia在CRC中的表达较正常粘膜组织无显著性改变（0.942±0.571 vs 1.063±0.386，P>0.05）；ADD3-Ib在CRC中的表达较正常组织明显减低（0.454±0.361 vs 1.097±0.497，P<0.01），50例中有42例（84%）减低；ADD3-Ia/Ib的比值在CRC中较正常组织显著升高（3.217±3.058 vs 1.051±0.361，P<0.01），见图1。
1.2 CRC组织病理分析 将50对CRC组织按照年龄（≦60岁vs >60岁）、性别（男vs女）、部位（直肠vs结肠）、大小（≦4cm vs >4cm)；根据美国癌症联合委员会(AJCC，American Joint Committee on Cancer)和国际抗癌联盟(UICC，Union for International Cancer Control)结直肠癌TNM分期（第七版）划分深度(T1-2 vs T3-4)、淋巴结转移(有vs无）。比较后发现ADD3-Ia的表达量在T3-4组中为2.119±1.246，显著高于T1-2组的1.081±0.405，（P<0.05）（图2）。
2 结直肠息肉组织表达量比较
ADD3-T、ADD3-Ia和ADD3-Ib表达在结直肠息肉组织中分别为1.050±0.806、1.105±0.486、1.13±0.615，均较正常组织0.807±0.320、0.845±0.440、0.617±0.429减少（P<0.01）；ADD3-Ia/Ib无显著性差异（P>0.05）详见图3。
3 SW620和SW480中的表达差异
ADD3-T在SW620中的表达量较SW480未见明显减少（P>0.05）；ADD3-Ia、ADD3-Ib在SW620中的表达量较SW480减少（P<0.05，P<0.01）；ADD3-Ia/Ib比值在SW620中较SW480升高（P<0.01），见图4。