慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是神经系统疾病中常见的一种慢性缺血性病理改变，多由于脑血管管腔狭窄、畸形、动静脉瘘形成等原因引起脑组织长期处于低灌注状态，脑部血流供应减少，神经元慢性缺血缺氧，最后导致脑组织不可逆性损伤。脑缺血缺氧后大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的产生和堆积造成脑组织氧化损伤，称为氧化应激（oxidative stress ）【1，2】。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG)是DNA氧化应激损伤后的主要产物，氧化应激造成DNA双链断裂、单链断裂、碱基修饰受损，可用于评估DNA氧化应激损伤的程度【3，4】。4-羟壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）是脂质氧化应激损伤常见的醛类产物，能与细胞内的核酸、蛋白酶类等物质发生一系列复杂的病理损伤反应，是评估脂质过氧化损伤水平的常用检测指标【5】；石榴汁(pomegranate juice)富含各种多酚类化合物，主要有没食子鞣质、逆没食子酸鞣质、鞣花酸、花青苷类等，它具有抗氧化、抗过敏、降脂、抗动脉粥样硬化、抗癌、抗炎症及抗菌免疫调节等多种功能【6】。石榴汁抗氧化作用的有效性在体内外研究中均已被广泛证实，然而石榴汁对慢性脑低灌注大鼠认知行为的影响还未明了。本实验基于永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，模拟大鼠在慢性脑低灌注状态下认知行为功能损害，探讨石榴汁对慢性脑低灌注状态下大鼠的认知行为和皮质与海马CA1区的8-0HdG和4-HNE的表达水平的影响，及石榴汁对此影响的作用机制。
材料与方法
一、材料
健康Wistar雄性大鼠40只，SPF级，购于湖北省疾病预防控制中心，体重200-250g，放置中南医院动物房饲养，每笼3只，保持适宜的温度、湿度和通风，保证每天充足水和食物。购买陕西临潼质好红酸石榴，经清洗、消毒、榨取、离心和低温真空浓缩器缓慢蒸发制备石榴汁，石榴汁中多酚类物质含量2.4-4.8mg/ml。
二、方法
1.慢性脑低灌注大鼠模型的制备（2VO模型） 随机分成3组，石榴汁组、2VO组和假手术组，分别是16只、16只、8只。术后3天和灌胃过程中共死亡17只，死亡率为42.5%。最后石榴汁组8只，2VO组7只，假手术组8只。
2.给药方法 术后1周开始给予药物干预，石榴汁组每天给予2ml石榴汁灌胃；2VO组与假手术组每天给予2ml糖水灌胃（蔗糖250mg，果糖20mg，葡萄糖20mg）；均于下午进行；共7周。
3.Morris水迷宫空间认知行为学检测
术后第8周，对3组大鼠进行Morri水迷宫的空间学习和记忆能力试验。Morris水迷宫直径150 cm，高60 cm圆形水池，上方安装摄象头观察与记录大鼠的行为轨迹。在水池壁上标记4个大鼠的入水点，分别记为A、B、C、D点；水池相应地分成4个象限。在第1象限正中点离池壁30cm处放置一个圆形平台，直径9cm，高30 cm。水深32cm，平台低于水面1.5cm，加入黑色墨汁防止大鼠看见水下平台，保持水温24±2℃。水迷宫测试时，实验室保持安静和亮度适中，训练期间迷宫外参照物保持不变。定位航行实验 (place navigation) 用于检测大鼠的空间学习能力。每只大鼠每天进行4次训练，每次分别从A、B、C、D点把大鼠投入到水池中，每天依次选择一个象限开始作为大鼠入水点，连续训练5天。观察和记录大鼠爬上平台所需时间，即为潜伏期时间（escape latency)。如大鼠60s内找到平台，记录大鼠找到平台的实际时间记为潜伏期时间。如60s内未找到平台，则将潜伏期时间记为60s，再把大鼠引到平台上和停留15s。每只大鼠训练时间间隔1小时。空间探索试验用于检测大鼠对原平台的空间记忆能力。定位航行实验结束后，间隔1天，去掉水池里的平台，随机选择一个象限作为大鼠入水点，观察并记录大鼠在30秒内在原先放置平台的第1象限游泳时间，每只大鼠进行4次检测，每次间隔时间l小时。
4.脑组织取材
Morri水迷宫试验结束后第2天行大鼠脑组织取材，根据大鼠体重给予0.35ml/100g的10%水合氯醛腹腔麻醉注射，后暴露心脏，快速灌注PBS液3-5min，待大鼠双肺和前肢变白时改用4％多聚甲醛脑灌注液经左心室开始灌注，大鼠出现剧烈抽搐，后肢绷直僵硬，鼠尾竖起成一直线，再行断头取脑术，后放置在4％多聚甲醛溶液中固定，24小时内石蜡包埋与切片，切取含大脑皮质和海马CA1区，厚度为5μm。
5.免疫组织化学染色
将3组大鼠的皮质和海马CA1区进行8-OHdG和4-HNE检测，严格按照试剂盒说明书进行操作，细胞膜为黄棕色时为阳性反应，8-OHdG试剂盒购买自香港Abcam公司，4-HNE试剂盒购买自美国ADI公司。每组内每张切片分别在皮质和海马CA1区随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析并得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）。IOD越大，阳性表达越强。每组所有照片的平均值代表该组的IOD，用均数±标准差表示。应用SPSS18.0进行显著性检验。
三、统计方法
数据统计方面，潜伏期时间用均数±标准差表示，双因素方差分析，采用F检验组间比较。目标象限游泳时间用均数±标准差表示，用单因素方差分析，两两比较采用T检验。8-OHdG和4-HNE含量用均数±标准差表示，采用单因素方差分析和LSD法统计学分析。当P＜0.05时，具有统计学意义。
结果
一、Morris水迷宫空间认知行为学试验
1.逃离潜伏期试验结果
首先，统计3组大鼠每天在4个象限中的潜伏期时间，取其平均值，得到大鼠当天的Morris水迷宫平均潜伏期时间。经过5天训练后，3组大鼠的组内平均潜伏期也有显著性差异（F4,100＝56.03，P<0.01）；第4、5天，2VO组潜伏期时间显著多于假手术组，差异具有显著性（P < 0.01），而石榴汁组潜伏期时间显著少于2VO组，差异具有显著性(P<0.05）。结果见表1。
表1 石榴汁对慢性脑低灌注大鼠空间学习的影响（Mean±SD，s）
组别 大鼠（只） 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
假手术组 8 49.2±7.3 30.8±10.3 22.8±9.8 12.7±7.7 7.7±5.6
石榴汁组 8 52.9±6.9 38.6±10.6 33.9±8.2 21.4±7.1 13.6±6.1
2VO组 7 51.9±6.4 41.8±8.11 40.6±13.0 33.8±12.2 25.9±11.3
P值 P > 0.05 P > 0.05 P > 0.05 ＜0.05 ＜0.05
注：与2VO组比较，潜伏期时间显著减少，P<0.05。
2.空间探索试验结果
主要用于检测大鼠对原平台位置的空间记忆能力。在30秒内，大鼠出现在原平台所在象限的时间，即为目标象限游泳时间。2VO组目标象限游泳时间(6.343±1.220s)较假手术组(10.05±1.688s)显著减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。石榴汁组目标象限游泳时间(8.950±2.371s)较2VO组显著增加，差异具有统计学意义 (P＜0.05)。
二、石榴汁对慢性脑低灌注大鼠8-OHdG的影响
在大鼠顶叶皮质和海马CA1区用8-OHdG免疫组化染色观察DNA氧化应激损伤程度。在慢性脑低灌注损伤后，顶叶皮质和海马CA1区含有大量呈黄棕色颗粒的8-OHdG阳性表达。3组大鼠皮质和海马CA1区8-OHdG的IOD分别是假手术组（1788.82±183.01、655.67±151.28）、石榴汁组（4130.40±213.55、1665.86±57.15）和2VO组（11515.34±921.73、2776.47±188.10）。结果显示：8-OHdG在皮质和海马CA1区的含量依次为假手术组<石榴汁组<2VO组，经石榴汁干预后，大鼠皮质和海马CA1区8-OHdG的表达较2VO组明显减少。经LSD法方差分析，P值均小于0.01，说明3组大鼠之间的皮质和海马CA1区8-OHdG表达具有差异性。结果如图1-6。(见附页)
图1-3分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠皮质8-OHdG的表达情况 （200倍视野）
(见附页)
图4-6分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠海马CA1区8-OHdG的表达情况（200倍视野）(见附页)

三、石榴汁对慢性脑低灌注大鼠4-HNE影响
在大鼠顶叶皮质和海马CA1区用4-HNE免疫组化染色观察脂质氧化应激损伤程度。在慢性脑低灌注损伤后，大鼠顶叶皮质和海马CA1区含有大量呈黄棕色颗粒的4-HNE阳性表达。3组大鼠皮质和海马CA1区4-HNE的IOD分别是假手术组（1459.47±233.57、442.22±62.98）、石榴汁组（3150.87±173.64、1501.96±252.77）和2VO组（8695.24±326.58、2546.31±430.74）。结果显示：4-HNE在大鼠皮质和海马CA1区的含量依次为假手术组<石榴汁组<2VO组，经石榴汁干预后，大鼠的皮质和海马CA1区4-HNE的表达明显减少。经LSD法方差分析，P值均小于0.01，说明3组大鼠之间的皮质和海马CA1区4-HNE表达具有差异性。结果如图7-12。
图7-9分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠皮质4-HNE的表达情况（200倍视野）(见附页)

图10-12 分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠海马CA1区4-HNE的表达情况（200倍视野）(见附页)

讨论
慢性脑低灌注状态在老年人中较为常见，经相关的临床检查常发现脑血流量减少和脑白质稀疏，常引起认知功能的下降。慢性脑低灌注引起脑组织缺血缺氧，后继发兴奋性氨基酸毒性、酸中毒、离子的失衡、氧化应激、炎症介质和细胞调亡等一系列复杂的级联反应，其中氧化应激损伤可能起着关键作用【7】。慢性脑低灌注时，脑组织的氧化应激系统与抗氧化激系统失衡，自由基代谢平衡紊乱，导致大量活性氧自由基的产生和堆积，造成神经元氧化应激性损伤。2VO模型常用于慢性脑低灌注损伤研究，永久性结扎双侧颈总动脉后脑组织缺血效果明显，大脑皮质、海马、脑白质和视觉系统最容易受到破坏，皮质与海马的脑血流量减少最为明显，减少达60-70%。术后1周脑血流减少最多，8周后手术组和对照组的脑血流量无显著差异,因此2VO模型适合用于慢性脑缺血研究【8】。Ni JW【9】研究发现2VO大鼠海马皮层、CAl区和白质进展性神经元损害和导致认知功能下降。Kazunori Miki【4】研究表明脑组织长期处于低灌注状态，氧化应激损伤大脑白质和灰质，继而发生退行性病变和认知功能障碍。在本研究中，2VO组大鼠皮质和海马CA1区的8-OHdG和4-HNE含量均较假手术组明显增多；2VO组大鼠平均潜伏期时间显著多于假手术组，而目标象限游泳时间显著少于假手术组；这说明慢性脑低灌注过程氧化应激可能引起大鼠DNA、脂质受损和认知功能下降。
4-HNE是脂质过氧化反应最具代表性的醛基产物，能与膜蛋白结合导致膜通透性增加和膜蛋白酶失活，或者损伤细胞膜受体，细胞代谢发生紊乱，从而引发疾病的发生。氧化应激同时引起DNA断裂、碱基修饰受损和破坏DNA修复酶、DAN聚合酶和DNA剪切酶等各种酶类物质，最终导致DNA在合成与分裂过程中发生异常。8-OHdG是DNA氧化应激损伤的主要产物，其含量可反应氧化应激损伤程度。