1.2.5 柠檬精油对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响

将RAW264.7细胞用胰蛋白酶（0.25%）消化，用完全培养基终止并调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，向96孔板每孔中加入细胞悬液90 μL，设置对照、模型(LPS)、给药(LPS+不同浓度精油)三个分组且每组6个复孔，培养24 h小时后除对照孔外，其余组每孔加入LPS使其终浓度为10 μg/mL，继续培养4 h。此后对照组和模型组中加入PBS缓冲溶液10 μL，给药组分别给予高中低三个剂量组的柠檬精油10 μL，再次培养24 h。培养时间结束后收集细胞上清液，根据相关试剂盒说明书操作，采用ELISA 法检测细胞上清液中TNF-α含量^[10]。

1.2.6 菌悬液的制备

取无菌棉棒，分别挑取待测菌种生长状态良好的1-2个单个菌落，置于无菌试管内，使用无菌注射器抽取适量0.9 % 氯化钠注射液，注入试管中使其待测菌种均匀溶解，配制成菌悬液，使用0.5麦氏比浊液进行比浊(约含菌1.0×10⁸ CFU·mL^-1)，进行稀释使其含菌量为1.0×10⁷ CFU·mL^-1，此操作过程需在20 min内完成^[11]。

1.2.7 阳性药的配制

注射用头孢曲松钠母液配制：取0.1 g的注射用头孢曲松钠粉末置于5 mL EP管中，加入2 mL 0.9% 氯化钠注射液，配制浓度为0.05 g/mL的母液备用。

硝酸咪康唑母液配制：取浓度为0.02 g/mL的硝酸咪康唑溶液200 μL置于5 mL EP管中，加入0.9 % 氯化钠注射液至2 mL，配置为0.002 g/mL的母液备用。

1.2.8 牛津杯法测定抑菌圈

将灭菌后培养基于无菌条件中倒入无菌培养皿中待其充分凝固，滴加100 μL混匀的菌悬液并利用无菌棉棒均匀涂布。取灭菌烘干的牛津杯放置培养基表面，每皿加入1-3个牛津杯，中心或并排或呈“品”字型放置。将不同浓度的头孢曲松钠和硝酸咪康唑及柠檬精油原液取200 μL加入牛津杯中，氯化钠注射液为阴性对照，试验重复三次。金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌37 ℃下培养24 h，白色念珠菌培养48 h，利用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果取平均值。牛津杯法感性判断标准：直径＜ 10 mm属于低敏；≥ 10 mm ~ ≤ 15 mm 属于中敏；＞ 15 mm ~ ≤ 20 mm属于高敏；＞ 20 mm属于极敏^[12-13]。