1.3 桃蛀螟CYP4G113在不同发育阶段和不同组织的表达
分别收集桃蛀螟卵（400粒）、1龄（80头）、2龄（40头）、3龄（20头）、4龄（10头）、5龄（6头）第一天幼虫、蛹（化蛹后第一天，6头）以及成虫（羽化后第一天，6头），用于分析CYP4G113在桃蛀螟不同发育阶段的表达量；同时收集桃蛀螟4龄幼虫的头、唾液腺、中肠、脂肪体、表皮和血淋巴等组织，用于分析CYP4G113在桃蛀螟幼虫不同组织中的表达量。每种样品设置3个生物学重复和3次技术重复。提取上述样品的RNA后，反转录合成cDNA备用，方法同1.2。
根据克隆获得的桃蛀螟CYP4G113序列，运用Primer 5.0软件设计荧光定量PCR所用目的基因引物CYP4G113-q−F和CYP4G113-q−R，同时以桃蛀螟甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）基因（GenBank登录号：KX668532.1）作为内参基因，设计内参基因引物GAPDH-F和GAPDH-R（表1）。以各样品反转录cDNA为模板，利用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 试剂盒（天根生化科技北京有限公司）进行qRT-PCR，反应体系：2´SuperReal PreMix Plus 10 mL，上下游引物（10 mM）各0.6 mL，50´ROX Reference Dye 0.4 mL，cDNA模板1 mL，RNase-Free ddH2O 7.4 mL。扩增程序条件为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，共40个循环。反应结束后采集Ct值，采用2-DDCT法[20]分析该基因在不同样品中的相对表达量。
