1.2  氨基酸序列分析与蛋白质三位结构模拟与分析

ManBs31氨基酸序列NCBI登录号为SMF62789.1。通过使用NCBI保守结构域搜索程序（Conserved Domain Search）预测ManBs31上保守结构域的组成和分布。ManBs31蛋白质序列与NCBI数据库中蛋白质序列的相似性通过使用BLASTp程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析。使用在线程序SignalP-5.0对ManBs31是否含有氨基端信号肽进行预测[15]。使用Clustal Ogema在线程序对ManBs31-GH5相关的蛋白质序列进行多序列比对分析。ManBs31-GH5的三维结构预测模型通过SwissModel在线服务器 (http://swissmodel.expasy.org/) 获得并使用MolProbity程序对获得的结构模型进行评估[16]。蛋白质三维结构的叠加分析和蛋白质结构图片的制作都在PyMOL软件中完成。

1.3  ManBs31-GH5在大肠杆菌中的表达及纯化

通过限制性核酸内切酶EcoR1和Not1将ManBs31-GH5基因片段连接至大肠杆菌表达载体pET-28a的多克隆位点。测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。含有重组质粒的BL21（DE3）细胞接种至200 mL的ZYM-5052培养基中[17]。接种后，先在37 ^oC，转速250 rpm的条件下培养4 h左右，然后将温度调节至16 ^oC，转速降至150 rpm，继续培养24 h。表达结束后，通过离心收集细胞并超声波破碎。通过高速离心（20000 rpm，1 h）收集破碎细胞的上清液。上清液经0.45 μm滤器过滤之后使用HisTrap凝胶柱进行亲和层析纯化。镍柱亲和纯化所用的缓冲液A含有0.5 M NaCl, 25 mM Tris–HCl, pH 7.4，用于上样和洗涤；缓冲液B成分为0.5 M NaCl, 25 mM Tris–HCl, 500 mM咪唑, pH 7.4，用于将重组蛋白质洗脱下来。最终的蛋白质样品透析到磷酸盐缓冲液中(140.0 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10.0 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4)。