2.3 Epsin2蛋白质纯化与鉴定

我们将Epsin2蛋白质经Ni-NTA亲和纯化（图4）。纯化后的Epsin2蛋白质通过FPLC对进一步纯化。根据FPLC波长曲线收集对应蛋白质组分，考马斯亮蓝染色验证蛋白质纯化效果（图5）。 最后将组分15与16混合浓缩至总体积约50 μL。

2.4 Epsin2体外液-液相分离实验

为验证Epsin2是否可以在体外发生液-液相分离，我们将Epsin2蛋白质加入缓冲液（Tris-HCl 50 mM，NaCl 50 mM，PEG3000 5%，DTT 1 mM），以模拟体内的环境。显微成像结果表明，当Epsin2蛋白质一定浓度下呈现规则的液滴状，而同样浓度的mCherry蛋白质作为对照组无液滴出现（图6）。随着Epsin2蛋白质浓度的升高，蛋白质聚集成的液滴逐渐增多且逐渐变大（图7），表明Epsin2蛋白质的液-液相分离是浓度依赖的。接下来在缓冲溶液中加入NaCl，使NaCl浓度达到 500 mM，观察到同样浓度下的Epsin2蛋白质液滴几乎完全消失（图8）。1，6-HD是一种小分子化合物，破坏类液体凝聚体。可以通过破坏氨基酸之间的弱相互作用，改变某些蛋白质的液-液相分离状态。Epsin2蛋白质加入NaCl 50 mM缓冲液中后加入5%的1，6-HD，同样浓度下Epsin2蛋白质液滴也消失。以上实验说明Epsin2蛋白质的液-液相分离可以被高盐和1,6-HD抑制。两者均证实了Epsin2形成的液滴与氨基酸电荷之间的弱相互作用相关。