1.3 基于原位测序的空间转录组技术

1.3.1原位测序（ISS）

2013年，Rongqin Ke等[30]开发了原位测序（in situ sequencing，ISS）方法，该方法在固定的组织或细胞中，首先将mRNA在原位逆转录成cDNA，然后用RNA酶使RNA降解，再通过锁式探针（padlock probe）与cDNA杂交，探针末端之间有缺口，通过DNA聚合和DNA连接可以使锁式探针形成一个完整的环，称为“DNA球”，之后通过滚环扩增（rolling-circle amplification，RCA）形成滚环产物（rolling-circle product，RCP），再在显微镜下观察荧光团偶联的寡核苷酸杂交，这是一个循环，在进行下一个循环之前，要将之前的探针冲洗干净，重复连接、成像、冲洗的步骤来进行下一个寡核苷酸的测序，直至几个循环完成，通过图像分析所获得的碱基顺序，以此实现原位测序.组织中可分辨的基因数量与荧光团的数量以及测序周期数有关，如4个荧光团和4个测序周期（得到4个核苷酸长度的序列），则可以解码44 = 256个不同的序列条码.ISS首次实现了对小RNA片段的组织原位测序.