1.2.4 高通量测序分析方法

1.2.4.1  DNA的提取和PCR的扩增

将分组鱼丸按不同时间分别取样约10g，放入灭菌袋中，磨碎，在超净工作台中加入90mL生理盐水于灭菌的锥形瓶中，震荡30min。将得到的浑浊液转移到离心管中，4℃，4000r/min离心10min去上清液于离心管中，4℃1000r/min离心20min,将沉淀转移EP管中并与-20℃下保存[6][7]。

以提取的细菌基因组DNA为模板选用细菌通用引物。正向引物8F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3')。

PCR反应体系为50ul，包括2uL DNA模板，1uL正向引物、1uL反向引物、25uL 2xTap MasterMix、21uL ddhH2O。PCR反应过程：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。

1.2.4.2测序数据处理

对IIIumina HiSeq测序的结果进行分析，去掉低质量的序列，根据Barcode确定对应样品，并去除Barcode和引物序列，最终得到有效的序列文件。利用Qiime软件进行质量控制[8]，将原始数据进行截取，并过滤掉其中连续高质量碱基长度小于序列长度75%的数据。经过以上处理后得到的序列与数据库[9]进行比对，检测并去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。