摘要：本实验旨在通过对比不同浓度的lip2000对转染滇南小耳猪成纤维细胞效率的影响并从中找出更为有效的转染方法。研究中采用以绿色荧光蛋白（GFP）为主体，CMV为启动子的PMAX质粒作为待转质粒，脂质体转染不同种植密度的滇南小耳猪成纤维细胞，实验首先对转染参数进行了系统化的摸索总结与优化，同时采用不同比例的lip2000转染，转染48小时后通过荧光显微镜和荧光酶标仪分别计算其转染效率。结果显示，滇南小耳猪成纤维细胞转染中DNA∶Lipofectamine2000 用量比例应控制在 1∶2；针对细胞密度为50％、70％、90％的转染效率分别为17.1％、 21.9％、33.7％。当细胞密度达到90％时转染率最高。
关键词:转染，滇南小耳猪，成纤维细胞，转染效率
前言
细胞转染技术是指通过一定的技术手段将表达质粒等外源基因载体导入真核细胞的技术方法。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛，也是基因克隆与表达的关键步骤之一。
目前，常用的转染方法主要有病毒包被法和非病毒载体法[1]。病毒包被法利用病毒对细胞的高度侵染能力，通过将病毒失活，低温高速离心后，收集病毒囊壳，并将目的质粒与病毒囊壳混合，从而对靶细胞进行侵染，达到将目的质粒转入细胞胞质中。这种方法可以有效达到转染目的，并可以通过利用病毒的特异性侵染的功能，达到目的质粒的选择性表达。但，也因其病毒毒性，并不能作为普遍的转染方法。而非病毒载体法具有低毒性、低免疫原性、目的基因片段范围广和靶向性强等优点，应用广泛。其中，以阳离子脂质体LipTM 2000转染法和电击转染法最为常见[2,3]。锌指核酸酶、TALENs、CRISPR/Cas9等人工改造的核酸内切酶的广泛应用，以及以二代Cas9为主的基因编辑技术的应用，基因编辑技术的日益成熟，但细胞转染都是其最为基本的技术保障。因此确立高效的、适合的细胞转染技术尤为重要。
文章证实，细胞转染条件与靶细胞的特性有潜在的联系，不同品系的细胞接收外源DNA的能力差别很大。滇南小耳猪作为云南本土猪型，因其身体短小，体型丰满而被越来越多的科研机构选为基因克隆的原始模型，开展对转基因克隆猪的研究。对促进人类医学研究、推动畜牧业的发展具有重大意义。选择合适的转染方式，适当的转染条件，对基因重组技术的应用于研究均具有重要意义[4-5]。本实验，通过绿色荧光蛋白基因的表达质粒在滇南小耳猪成纤维细胞上进行转染，系统的比较其转染效率，优化转染条件，为稳定转染、筛选转基因细胞并产生转基因克隆猪提供基础资料。
作者：刘晋冀