摘要：为建立CSFV和BVDV的鉴别检测方法，本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5´-UTR基因保守区域设计特异性引物和TaqMan探针，构建阳性重组质粒，优化反应条件，建立了双重RT-qPCR检测方法。该方法CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μl，具有良好的特异性和重复性；对206份猪病料进行检测，CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性，与本实验室常用单项 RT-qPCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-qPCR整个检测过程不到3h，采取闭管反应，检测完毕直接处理，避免开盖造成气溶胶污染，具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点，可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测，为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。
关键词：RT-qPCR；CSFV；BVDV
猪瘟病毒（ Classical swine fever virus，简称CSFV）和牛病毒性腹泻病毒( Bovine viral diarrhea virus ，简称BVDV)同属于黄病毒科、瘟病毒属 [1]，BVDV与CSFV的核苷酸序列约有60%的同源性，氨基酸约有85%的同源性，多克隆抗体对两种病毒具有血清学交叉反应[2]。现阶段，猪瘟的防控通常采用猪瘟兔化弱毒疫苗（Ｃ株）进行接种预防，该疫苗是世界上公认的最有效和安全的弱毒疫苗，对猪瘟的防控起到了重要的作用[3]。不同免疫程序对猪瘟疫苗免疫效果的研究较多，已形成了常规的免疫程序[4]。然而，在免疫良好的猪场仍有非典型猪瘟的发生[5]，基于国内已证实BVDV 可自然感染猪[6]，且CSFV与BVDV在自然条件下感染猪，出现类似非典型猪瘟的临床症状和病理变化[7]，不少专家怀疑出现非典型猪瘟的病例可能是猪感染BVDV造成的。目前，针对CSFV和BVDV感染的联合检测方法还未完善,而对猪源BVDV荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR, qPCR）的检测也仍然处于探索阶段。本研究基于TaqMan探针技术建立双重RT-qPCR检测方法，用于CSFV和BVDV的临床检测，为２种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。
1 材料和方法
1.1 病毒 CSFV、BVDV-1（BVDV/Oregon C24V）、BVDV-2（BVDV/XJ-04）、PRRSV、PRV、PCV-2、PEDV和TGEV毒株及206份临床猪病料均由山东省动物疫病预防与控制中心保存。
1.2 主要试剂 病毒RNA柱式提取试剂盒购自北京森康生物技术开发有限公司；猪瘟病毒荧光RT-PCR检测试剂盒、牛病毒性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自于生工生物工程股份有限公司；Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒，购自Promega公司；大肠杆菌感受态DH5α、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司。
1.3 引物设计与合成 根据GenBank公布的CSFV（LT158502.1）、BVDV（AJ133738.1）基因组序列，使用Oligo6.0软件设计引物及探针（表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
作者：韦雪华