一、Western blot

将U251细胞分为阴性对照(NC)组、siRNA敲低MCM5组1(si-1)、siRNA敲低MCM5组2(si-2)分别转染，转染48小时候用RIPA裂解液(杭州弗德生物科技有限公司)提取细胞的总蛋白，采用BCA(Takara)法定量。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭后，与一抗（MCM5,1:1000稀释，Santa Cruz；GAPDH，1:1000稀释，杭州弗德生物科技有限公司）在4℃下孵育过夜。在PBST清洗后，将膜与二抗在室温下孵育1h，然后暴露于增强化学发光剂中。