用PBS缓冲液将粪便样品稀释10倍，在涡旋仪上振荡混匀10 min后，4200 g离心5 min，取上清液用于核酸提取；猪小肠样品放于EBSS缓冲液中（10% wt/vol）震荡悬浮，4200 g离心5 min，取上清用于核酸提取。参照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，并利用反转录试剂盒制备反转录cDNA，-80 ℃保存备用。

2.3 质粒模板标准品的制备

以PEDV、TGEV、PDCoV和GAR的cDNA为模板，用合成的特异性引物进行PCR扩增，目的条带与EZ-Blunt Zero pTOPO II vector连接，转化至DH5α感受态细胞，挑取单菌落培养后提取质粒，测序验证。将测序正确的质粒作为模板，进行后续的单一RT-PCR和四重RT-PCR扩增。