以各菌种基因组DNA作为模板，进行PCR获得各菌种特异性目的片段，引物序列如表2所示。PCR体系包括：2×HiFi PCR SuperMix（含Taq 酶和dNTP）25 µL，上下游引物 （10mM）各1µL，ddH₂O 补至50 µL。PCR 反应条件为95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，反应30个循环；反应前95 ℃预变性5 min；反应结束72 ℃保持10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结束，使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。

胶回收产物连接至TOPO载体。连接体系如下：胶回收产物2 µL，M5 Hiper pToPo-TA vector 1 µL，10×Enhancer 1 µL，ddH₂O 补齐至10 µL。混匀，50 ℃连接 15-30 min。

连接产物转化至感受态细胞DH5α中，步骤如下：（1）取50 µL冰浴融化的感受态细胞，加入5 µL目的DNA，混匀，冰浴放置30 min；（2） 42 ℃水浴热激45 s，然后快速置于冰浴2 min；（3）向每个离心管中加入500 µL不含抗生素的LB培养基，混匀后置于摇床37 ℃，200 rpm振荡培养1 h，使细菌复苏；（4）取出200 µL培养基涂布于含有氨苄的平板上至液体被吸收，37 ℃倒置培养过夜。