1.3.2.3 HepG₂细胞中pokemon蛋白表达量检测

采用RIPA裂解液提取各组细胞中的总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，置于-80℃冰箱保存备用。进行Western blot时，首先制作10%分离胶和5%浓缩胶，从冰箱中取出蛋白样品，加入5×SDS缓冲液，煮沸5min，然后进行上样，每个孔的上样量为40μg。设置起始电压为8V/cm，当溴酚兰进入分离胶时电压调整为15V/cm，电泳至溴酚兰刚刚涌出时结束。电泳完毕后将凝胶中蛋白转移至NC膜上，5%的封闭液封闭2h后，加入一抗（兔抗人pokemon蛋白多克隆抗体，1:200），4℃过夜；洗膜，再加入二抗（羊抗兔IgG-HRP，1:10000）孵育1h，洗膜后进行ECL显色，计算pokemon蛋白表达的相对强度。pokemon蛋白表达的相对强度=pokemon条带灰度值/β-actin条带灰度值。