利用CRISPR/Cas9系统构建TiKi1和TiKi2双基因敲除兔

摘要：

Tiki基因为哈佛大学儿童医学院贺熹教授的实验室最新发现的基因，在蛙上进行的功能研究实验证实了Tiki确实在头部诱导的过程中起着决定性的作用。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1两种类型，因此最好建立一种同时敲除TiKi2和TiKi1两种基因的兔模型，才能更好的研究TiKi基因是否影响兔头部的早期发育。但TALENs的打靶效率尚难以完成该项研究，更受科学家们青睐的CRISPR/Cas9 系统在多基因打靶上具有独特的优势。利用 CRISPR/Cas9 系统已经在人的细胞、小鼠、大鼠和猴子上实现了一步多基因修饰，这对于建立由多基因导致的人类疾病动物模型提供了一种很有潜力的工具。本研究通过CRISPR/Cas9 系统结合原核期受精卵 RNA 胞质内显微注射来建立家兔双基因打靶技术体系。考虑到TiKi1和TiKi2的同源性比较高，可能相互之间存在补偿效应，于是我们设计了一个gRNA能同时靶向TiKi1和TiKi2。本研究将200ng/µL Cas9 mRNA和20ng/µL gRNA注射到51个处于原核期的家兔受精卵的胞质内，移植到6只受体兔体内，共计生出12只仔兔，经测序鉴定其中有1只仔兔为TiKi1和TiKi2双等位基因敲除模型。结果表明 CRISPR/Cas9 系统对于家兔双基因修饰研究是一种高效和简便的工具。在本研究中成功建立的TiKi1和TiKi2双基因敲除兔模型在评估新药疗效、基因治疗等的研究领域中将具有很大的应用潜力。

关键词：家兔，CRISPR/Cas9 系统，双基因打靶，Tiki1，TiKi2