猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力替代检测方法的建立及应用

摘要  为了建立猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力的替代检测方法，本研究以纯化提取的猪肺炎支原体抗原蛋白作为包被抗原，以兔抗猪肺炎支原体阳性血清为一抗，建立待检抗原与包被抗原竞争的抗原ELISA相对效力值检测方法。通过对包被抗原浓度、阴阳性血清浓度、封闭液及封闭条件、酶标二抗浓度等条件进行筛选优化，建立猪肺炎支原体竞争ELISA检测方法，同时对方法的质控条件、敏感性和特异性进行了确定；利用该方法进行猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效力的相对效力检测，对相对效力检测方法的重复性进行了检测，并在猪圆环病毒、肺炎支原体二联灭活疫苗中试产品的免疫效力评价中进行了应用。结果，通过筛选优化建立了猪肺炎支原体的竞争ELISA体系，其包被抗原浓度为16μg/ml，阳性血清稀释度为1:25000，阴性血清稀释度为1:160；封闭液为5%脱脂奶粉，封闭时间为1.5小时；酶标二抗稀释度为1:20000，作用时间1.0小时；TMB显色时间为室温15分钟；实验成立条件为：阳性血清OD450吸收值为0.7～2.0，阴性血清OD450吸收值＜0.3；该方法线性相关系数≥0.99，线性范围为10μg/ml～1280μg/ml，与猪鼻支原体等8种异源蛋白无交叉反应。建立了猪肺炎支原体相对效力的竞争ELISA检测方法，批内重复性变异系数＜5%，批间重复性变异系数＜10%。猪圆环病毒、肺炎支原体二联灭活疫苗的5批中试产品的相对效力值分别为1.32、1.48、1.62、1.49、1.30，对应批次疫苗的本动物免疫攻毒保护试验结果均满足疫苗质量标准要求。本研究所建立的猪肺炎支原体竞争ELISA方法可以用于检测猪肺炎支原体灭活疫苗相对效力值，该方法可以替代本动物试验对猪肺炎支原体灭活疫苗效力进行评价。

关键词  猪肺炎支原体，灭活疫苗，竞争ELISA ，相对效力值