大鼠体内Pig-a基因突变试验影响因素研究

摘要：目的 为进一步完善和推广应用Pig-a基因突变试验，本研究拟在本实验室建立的试验方法基础上，对影响试验结果稳定性的三种主要影响因素进行探讨。方法 将15只雄性SD大鼠按照体质量随机分为3组：溶媒对照组（PBS，pH=6.0）、ENU 20和80 mg/kg剂量组。连续经口灌胃3 d，于给药后28 d取血待检。按照本实验室已建立的流式细胞术Pig-a基因突变试验双染（CD59-APC/SYTO 13）或三染（CD59-APC/CD61-PE/SYTO 13）方案，针对网织红细胞突变频率（mutant red blood cells，RBC^CD59−）、成熟红细胞突变频率（mutant reticulocytes，RET^CD59−）和网织红细胞比例三项指标，分别进行多项影响因素检测：样本贮存液和贮存时间（肝素钠抗凝剂和血液保存液-1 [枸橼酸-磷酸-葡萄糖-腺嘌呤，citrate phosphate dextrose adenine-1，CPDA-1]，0 ~ 6 d）、样本染色前贮存时间（0 ~ 24 h）和样本染色后固定和贮存时间（1 %多聚甲醛，0 ~ 24 h）。结果 使用双染方案时，4 ℃避光保存条件下，CPDA-1保存6 d内RBC^CD59-、RET^CD59-和RET比例指标均未见明显影响（p>0.05）；而肝素钠溶液第3 d 即可观察到RET^CD59-显著升高（p<0.05）。肝素钠溶液4 ℃避光保存24 h时使用三染方案检测对三项指标无明显影响（p>0.05）；而6 h时使用双染方案检测可观察到RET^CD59-显著升高（p<0.05）。双染方案染色后，与未固定样本比较，1 %多聚甲醛固定可导致RET^CD59-和RET比例显著改变（p<0.05）。结论 使用CPDA-1保存血液样本时（避光4℃），可使样本保存时间延长至6 d（双染方法）。使用肝素钠溶液保存血液样本时（避光4℃），双染方法检测时间需在6 h内，而三染方法检测时间可延长至24 h。1 %多聚甲醛固定可能不适用于Pig-a基因突变试验。

关键词：Pig-a基因突变；流式细胞术；大鼠；CPDA-1；样本贮存时间；多聚甲醛